蛋白酶活力测定方法(福林法)

出处：按学科分类—工业技术 轻工业出版社《制革手册》第40页（2768字）

(一)原理

磷钨酸和磷钼酸混合试剂(福林试剂)在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原而呈现蓝色(钨蓝、钼蓝)。由于蛋白质中含有具酚基的氨基酸(主要是酪氨酸)，蛋白酶作用于蛋白质生成含酚基氨基酸和其它的水解物，与福林试剂反应就呈现蓝色。利用这个反应特征，就可表示蛋白酶的活力。

(二)试剂制备

1．福林试剂：在2000毫升磨口回流装置内加入；

钨酸钠(Na₂WO₄·2H₂O) 100克

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 25克

蒸馏水 约700毫升

磷酸(含85%H₃PO₄) 50毫升

浓盐酸 100毫升

将上列化合物混合后，用温火回流煮沸10小时，然后加入硫酸锂(Li₂SO₄)100克，水50毫升和几滴溴水，摇匀。除去冷凝器，再煮15分钟，以除去多余的溴，溶液呈现金黄色。冷却后，在1000毫升容量瓶中稀释至刻度，过滤备用。试剂不能呈现绿色，应为金黄色。否则需再加溴水，重复处理操作。装置在棕色瓶内，使用时以试液一份加蒸馏水二份进行稀释配成1∶2福林试剂。

2．0．4克分子碳酸钠溶液：将42．4克无水碳酸钠(Na₂CO₃)溶解在1000毫升容量瓶中配制。

3．0．4克分子三氯乙酸溶液：将65．3克三氯乙酸(Cl₃C·COOH)溶解在1000毫升容量瓶中配制。

4．磷酸缓冲液：

0．2克分子的磷酸缓冲液配制法(在1000毫升容量瓶中配制)。由于配制时所用试剂的结晶水不同，用量按分子量计算如表2－3。

表2－3 磷酸缓冲液配制

缓冲液的配比见表2－4。

表2－4 缓冲液的配比

举例：取0．2克分子的磷酸氢二钠72毫升和0．2克分子的磷酸二氢钠28毫升混和在100毫升容量瓶中，测定pH值应在7．2。否则需要调正。使用时浓度稀释10倍至0．02克分子。

上例配比系按中性蛋白酶测定要求的。如果应用的蛋白酶最适pH值不在7．2，可根据情况要求，按表2－4采用不同配比的缓冲液。

5．2%乳酪素溶液：称取2克乳酪素，加1～3毫升0．5当量的氢氧化钠(NaOH)润湿，再加入约50毫升pH值为7．2的0．02克分子的磷酸缓冲液。在沸水浴中不断搅拌，使它完全溶解，冷却，再加20毫升pH值为7．2的0．02克分子的磷酸缓冲液。用0．5当量的氢氧化钠或0．5当量的盐酸调正pH值至7．2，再用0．02克分子的磷酸缓冲液在容量瓶中稀释至100毫升。然后放在冰箱中保存备用。或现用现配，以保证乳酪素溶液不变质。

(三)测定操作

在试管中加1毫升适当稀释的酶液或酶粉溶液(酶粉因活力较高，需在事前稀释，一般称重后以40℃温水溶解，再以缓冲液稀释，稀释倍数由活力高低而定)，在40℃的恒温水浴中预热1～2分钟，加入已经预热40℃的2%乳酪素溶液1毫升，精确反应10分钟(自加入乳酪素溶液开始，精确计算记录时间)，加入0．4克分子的三氯乙酸溶液2毫升，就终止反应。再保温10分钟等待沉淀完全，过滤。取滤液1毫升，加0．4克分子的磷酸钠溶液5毫升，加1∶2福林试剂1毫升，然后在40℃恒温水浴中显色10分钟，取出冷却。在680毫微米(mμ)下比色测定光密度(O．D．)。同时做一个空白，酶液先加0．4克分子的三氯乙酸溶液2毫升，再加2%乳酪素溶液1毫升。同样操作测定光密度。

(四)标准曲线的制备

1．标准酪氨酸溶液配制方法：精确称取已烘干的酪氨酸0．1克，加入1当量的盐酸6毫升进行溶解，再用0．2当量的盐酸在100毫升容量瓶中稀释至刻度，成为100微克／毫升。稀释液的配制见表2－5。

表2－5 稀释液的配制

2．测定方法：将1毫升酪氨酸稀释液，加5毫升0．4克分子的碳酸钠，加1毫升1∶2福林试剂。在40℃恒温水浴中显色10分钟，取出冷却。在680毫微米下比色测定光密度。

根据酪氨酸的量和对应的光密度绘制曲线。求K值。

K是比色计常数，即每1°光密度所相当酪氨酸的微克数。

(五)计算

蛋白酶活力(pu)的定义为在上述条件下，每分钟由酪蛋白所生成的三氯乙酸可溶物的福林试剂呈显蓝色度与1微克酪氨酸相当时，为一个蛋白酶活力单位。计算方法如下：

式中 ⊿O．D．=O．D．样品－O．D．空白

K=比色计常数

N=酶液稀释常数

解释：标准曲线是直接显色，而样品是由4毫升的反应液(1毫升酶液+1毫升乳酪素溶液+2毫升三氯乙酸)中吸取1毫升进行显色的，所以样品应乘以4。由于反应是在10分钟进行的，而定义是1分钟，所以要除以10(若制备标准曲线时，以酪氨酸的浓度×4为横座标，计算公式中就不需要×4)。